將銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa  DSM 50071_T 接種到 -Slide I Luer _0.8 通道載玻片中，培養3天。為促進細胞貼壁及表面生物膜的形成，在培養約36小時后更換培養基，以去除游離細胞。為確認生物膜的形成，在生長培養基中添加了無毒光學示蹤劑EbbaBiolight 680，該試劑適用于活細胞成像，它與細胞外基質中的蛋白質及多糖結合時會發出紅色熒光，從而可作為細菌生物膜的可視化標記。

　　

　　基于用DAPI進行DNA染色并用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）成像的結果，細菌細胞附著并主要形成單層或雙層結構。通過光學示蹤劑發出的熒光信號增強，可以識別出更厚的生物膜結構。本實驗旨在在同一張載玻片上結合多種成像技術。因此，在CLSM成像后，將細胞固定在同一張載玻片上，進行脫水處理，然后干燥，以便用于掃描電子顯微鏡（SEM）成像。實驗室自制了一個3D模具，用于分離蓋玻片，確保在操作過程中不破壞貼壁細胞的空間結構。隨后，在分離出的蓋玻片上，對形成的細菌細胞層進行2000倍至15000倍的放大成像。

　　

 

　　1、材料與試劑

　　銅綠假單胞菌培養物 Pseudomonas aeruginosa culture（DSMZ，50071）

　　胰蛋白酶胨（Thermo Fisher Scientific，211705）

　　大豆蛋白胨（Millipore，1.07212）

　　葡萄糖（VWR，24379）

　　氯化鈉（NaCl，VWR，27800）

　　磷酸氫二鉀(K2HPO4, Sigma, P3786)

　　磷酸鹽緩沖液（PBS，Sigma，P7994）

　　EbbaBiolight 680（EbbaBiotech AB）

　　4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, stock conc. 1 mg/mL, Thermo Fisher Scientific, 62248)

　　25%戊二醛（Sigma，G7776）

　　去離子水(diH²O)

　　無水乙醇（Sigma，34852-M）

　　

 

　　1.2 緩沖液與溶液

 

　　培養基

　　Tryptic soy broth (TSB; 17 g/L tryptone, 3 g/L peptone from soymeal, 2.5 g/L glucose,5 g/L NaCl and 2.5 g/L K²HPO⁴)

　　TSB supplemented with 1:1000 EbbaBiolight 680

 

　　洗滌緩沖液

　　1xPBS

 

　　染液

　　1:1000 DAPI in 1x PBS (*終濃度為1 g/mL)

 

　　30%、50%、70%、90%、100% (v/v)無水乙醇稀釋液

　　混合適當體積的去離子水和無水乙醇制得。

　　

 

　　1.3 儀器與設備

　　-Slide I Luer _0.8 通道載玻片，ibiTreat組織處理（ibidi，80196）

　　層流柜

　　通風櫥

　　30°C恒溫培養箱

　　55°C恒溫培養箱

　　移液器

　　冰箱

　　干燥器

　　手術刀或刀片

　　剪刀

　　鑷子

　　切割模具（如圖1所示）

　　倒置共聚焦顯微鏡（此處指：ZEISS LSM 880）

　　ZEN black 2.3 SP1

　　(Fiji Is Just) ImageJ 1.54f

　　掃描電子顯微鏡（JEOL JSM-6480LV）

　　金鍍膜（此處指：JEOL JFC-1200 精細鍍膜機）

　　碳膠帶

　　JEOL JSM-6480 version 7.07

圖1：切割模具示意圖—白色線條表示切割位置，沿著 -Slide I Luer _0.8 載玻片(底部)與儲液池外邊側(頂部)

2、實驗步驟

 

 

　　　2.1 細菌生物膜附著

　　操作-Slide I Luer _0.8 前請閱讀說明書，并遵循-Slide通用移液及液體更換建議。所有步驟需在無菌條件下進行。

　　實驗開始前，將銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa DSM 50071）接種于LB培養基（如100 mL錐形瓶），30°C、160轉/分鐘避光振蕩培養過夜。按供應商說明，將培養物以1:100比例稀釋于含1:1000光學示蹤劑（optotracer）的培養基中（注：細胞濃度未調整至供應商推薦的值）。

 

　　關鍵提示：需將所需材料（如-Slide）置于30°C培養箱中平衡過夜。平衡處理可確保材料溫度與環境一致，從而避免后續操作中因溫差導致氣泡形成。

　　1.根據說明書，將200 L稀釋菌液注入-Slide I Luer _0.8 通道載玻片，并用隨附的蓋子密封載玻片。

　　2.室溫（RT）避光靜置2小時，使細胞沉降并附著。

　　3.向每個儲液池加入60 L含光學示蹤劑的TSB培養基，并用蓋子封閉兩側儲液池。

　　4.將-Slide于30°C避光靜置培養1-2天。

　　5.按說明書從一側儲液池吸取100 L液體，并加入100 L新鮮配制的含光學示蹤劑TSB培養基，完成培養基更換。

　　6.重復上一步驟5-10次，確保培養基完全替換，避免氣泡產生。

　　7.向-Slide儲液池注入60 L無細胞補充TSB培養基。

　　8.再次將-Slide置于30°C避光靜態條件下孵育1至2天，促進進一步貼壁及生物膜形成。

 

 

　　2.2 DAPI染色及共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察

　　染色直接在-Slide I Luer _0.8 中進行，所有步驟需在通風櫥內完成。

 

　　關鍵提示：避免一次性移除通道內全部液體，防止細胞干燥。

　　1.置換為1×PBS緩沖液：從一側儲液池移除100 L培養基，向另一側加入100 L 1×PBS沖洗液。

　　2.重復步驟1（5-10次），直至培養基完全被1×PBS替代。

　　3.DAPI染色：按上述移液技術，將1×PBS替換為DAPI染色液，確保通道完全充滿。

　　4.室溫避光靜置孵育 -Slide10分鐘。

　　5.按照之前的移液技術，使用去離子水（diH²O）沖洗兩次，去除多余染料。

　　6.按照之前的移液技術，*后用1×PBS沖洗一次。

　　7.成像：使用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）拍攝附著細胞（圖2）。

　　8.將-Slide于4°C冷藏保存（未固定樣品*長2天），以待后續處理。

圖2：共聚焦顯微鏡下染色的銅綠微囊藻生物膜（紅色：EbbaBiolight680（Cy3.5），藍色：DAPI）。63x物鏡。細胞大多呈單層附著。一些類似于生物膜的三維結構清晰可見，尤其是在紅色信號較強的部分，突出顯示了光學示蹤劑與生物膜成分的結合。

2.3 SEM 樣品制備

　　樣品制備直接在-Slide I Luer _0.8 中進行，所有步驟需在通風櫥內完成。

 

　　關鍵提示：請勿一次性移除通道內的全部液體，避免細胞干燥。所有清洗與溶液更換步驟均按說明書要求執行：從一側儲液池移除100微升溶液1，并向對側儲液池加入100微升溶液2。重復此操作直至溶液完全替換。

　　1.固定：按2.2節步驟1的移液技術，將通道及儲液池內1×PBS替換為含2.5%戊二醛的1×PBS溶液，以固定貼壁細胞

　　2.室溫孵育載玻片3-4小時（或4°C過夜）。

　　3.用1×PBS沖洗至少5次，徹底去除戊二醛。

　　4.梯度脫水：依次用30%、50%、70%、90%無水乙醇孵育15分鐘/次，使附著的生物膜脫水。

　　5.完全脫水：100%乙醇處理兩次，每次20分鐘。

　　6.干燥：將通道載玻片置于55°C培養箱中干燥，不要蓋上蓋子，直至液體完全蒸發（本實驗干燥2小時）。

　　7.將-Slide保存于干燥器中以待后續處理。

　　8.樣品切割：按示意圖（圖3）用手術刀或刀片切割載玻片。

　　9.切割后的載玻片豎直存放于干燥器內（可保存數周）。

　　10.鍍金：將載玻片切割為≈1 cm小段，鍍金兩次（圖4）后用于電鏡觀察。

圖3：-Slide I Luer _0.8 載玻片切割示意圖。紅色虛線為切割線，彩色區域為可移除的蓋玻片部分。
圖4：附著于-Slide I Luer _0.8 載玻片的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）細胞及生物膜的掃描電鏡成像。（A）2000倍與（B）7500倍放大圖像。