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探討流體剪切力對細胞活動的影響
2016-05-05 13:32:00 來源：
一、實驗準備實驗材料及設(shè)備 細胞： 內(nèi)皮細胞、巨噬細胞 納米顆粒：pPDA：在800nm直徑的二氧化硅表面包被多聚多巴胺（dopamine） pPEG：在800nm直徑的二氧化硅表面包被多聚乙二醇（ethylene glycol） pRGD：在800nm直徑的二氧化硅表面包被L-精氨酸、甘氨酸和L-天門冬氨酸的多聚物（Arginylglycylaspartic acid ( RGD ) is a tripeptide composed of L -arginine , glycine , and L -aspartic acid） 培養(yǎng)耗材：ibidi六通道載玻片μ-Slide VI0.4 Luer （ibidi，Germany，80606） 灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962） 串聯(lián)管（ibidi，Germany，10830） 封口夾 儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903） 實驗方法 在實驗開始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置過夜，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。
二）培養(yǎng)細胞 準備內(nèi)皮細胞和巨噬細胞，按照常規(guī)細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。*好使用比較健康的內(nèi)皮細胞，以防在做流體實驗時候細胞不能穩(wěn)定貼壁。 按照下面流程鋪細胞： 按每通道10000個巨噬細胞和40000個內(nèi)皮細胞將細胞鋪于通道載玻片的中，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細胞懸液充滿整個通道。 蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時，等待細胞貼壁。細胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基。 將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)2-4小時左右，等到細胞剛剛長滿為單細胞層，即可開始實驗。注意，要使用單層細胞進行剪切力實驗，使每個細胞均受到均勻的剪切力。
二、搭建流體系統(tǒng) 將灌流管按照說明放在置在流體單元上。在灌流管的儲液管中加入含納米顆粒的7.5ml培養(yǎng)基。這時不需要連接通道載玻片。實驗前需要去除整個灌流管中的氣泡，存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會影響剪切力的大小，有時還會使灌流系統(tǒng)中的液體流動停滯。打開ibidi泵控制系統(tǒng)，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動運行下面任務(wù)，用于去除氣泡。（表一） 連接通道載玻片。使用串聯(lián)管，將通道串聯(lián)起來。這樣可以在同一個條件，同一種液體的刺激下培養(yǎng)不同的樣本。
在細胞貼壁后，將串聯(lián)管如如圖示插入串聯(lián)管 在每一個注液孔中加滿培養(yǎng)基，要注意不能把氣泡加入在注液孔中。 用1ml的無菌注射器吸滿培養(yǎng)基，小心插入如圖的孔中，不要引入氣泡。 小心推入培養(yǎng)基，直到*個串聯(lián)管有培養(yǎng)基微微冒出。 小心的將串聯(lián)管彎過來，插入相鄰的注液孔中。不要產(chǎn)生氣泡。 繼續(xù)推動注射器，直到第二根串聯(lián)管也被充滿，繼續(xù)推動注射器充滿下一根串聯(lián)管。 重復(fù)上面的操作，繼續(xù)充滿所有的通道和串聯(lián)管。 將所有的串聯(lián)管連接好后，將加滿液體排除氣泡的灌流管用封口夾夾住。 小心將灌流管的一個魯爾接頭從聯(lián)通管中拔出，插入*后一個注液孔中。 小心將注射器移除，在注液孔中加滿培養(yǎng)基，將灌流管的另一個接頭插入。 串聯(lián)灌流系統(tǒng)搭建完成。
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